Catepsina S: estudo da especificidade e influência da força iônica em sua atividade catalítica

Catepsina S: estudo da especificidade e influência da força iônica em sua atividade catalítica

Título alternativo Cathepsin S: study of the specificity and influence of ionic strenght in its catalytic activity
Autor Oliveira, Marcela de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Carmona, Adriana Karaoglanovic Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo A catepsina S é uma cisteino-peptidase lisossomal caracterizada como endopeptidase e sem nenhuma atividade exopeptidase detectada. A importância funcional dessa enzima tem sido extensivamente explorada, no entanto, ainda não se conhece o seu substrato natural e o seu exato papel em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos. A catepsina S apresenta uma característica única entre as cisteino-peptidases lisossomais degradando proteínas não somente em ph ácido, mas também em pH neutro. Essa característica sugere que a enzima possa estar envolvida em processos extracelulares, sendo a força iônica e a estabilidade da enzima, importantes para manter a atividade enzimática fora dos lisossomos. Fizemos um estudo da especificidade dos subsítios S2 a S2’ da catepsina S recombinante humana utilizando substratos peptídicos com supressão intramolecular de fluorescência derivados da seqüência líder Abz-KLRFSKQ-EDDnp (Abz= ácido orto- amino benzóico; EDDnp= N-[2,4 dinitrofenil] etilenodiamino). Foram ensaiadas quatro séries de peptídeos: Abz-KLXSSKQ-EDDnp, Abz-KXRSSKQ-EDDnp, Abz- KLRXSKQ-EDDnp e Abz-KLRSXKQ-EDDnp (X= diferentes aminoácidos). Os nossos resultados indicaram que o subsítios S1 não apresenta especificidade restrita, aceitando preferencialmente resíduos positivamente carregados (Arg, Lys) e resíduos hidrofóbicos de cadeia alifática (Leu Val). O subsítio S2 é mais restritivo preferindo resíduos hidrofóbicos de cadeia alifática (Leu e Val) e o resíduo polar não carregado Met. O subsítio S1’ acomoda bem resíduos hidrofóbicos de cadeia alifática, sendo o peptídeo Abz-KLRLSKQ-EDDnp hidrolisado com a maior eficiência catalítica de toda a série. O subsítio S2’ é o menos restritivo aceitando diversos resíduos de aminoácidos. Estudamos ainda o efeito dos sais sobre a atividade catalítica da catepsina S. Uma significante ativação da hidrólise da seqüência líder Abz-KLRSSKQ-EDDnp foi promovida na presença de 2.5 m de NaCl, sendo a atividade da enzima nestas condições 7 vezes maior que na ausência de sal. O efeito do pH na hidrólise do peptídeo Abz-KLRSSKQ-EDDnp foi estudada na faixa de 4,0 a 9,0. A curva obtida indica que o ph ótimo da enzima é por volta de 6,5, porém a catepsina S ainda conserva uma boa atividade em pH neutro e levemente básico, o que a difere das outras catepsinas que preferem pH ácido. De acordo com os estudos de especificdade, pH e força iônica estabelecemos condições possíveis de diferenciar a catepsina S das outras catepsinas. Desenvolvemos para este trabalho peptídeos derivados de possíveis substratos naturais da catepsina S como a cadeia invariante, a cadeia  da insulina e peptídeos - amilóide. O peptídeo Abz-ATPLLMQ-EDDnp, derivado da cadeia invariante, ensaiado em 50 mM de fosfato de sódio e 2.5 mM EDTA, pH 7.5, na presença de 1M de NaCl, foi bem hidrolisado pela catepsina S e resistente à hidrolise pelas catepsinas L, V, K e B. Todas estas enzimas foram pré-ativadas com 5 mM de DTT antes da adição do substrato. ((3)) e teluranas orgânicas (compostos 5 e 6) como inibidores das catepsinas S e L. Os três compostos derivados de nitroolefinas foram muito melhores inibidores para a catepsina S (composto1: IC50 = 8,5 µM; composto 2: IC50 = 3,1 µM; composto 3: IC50 = 1,6 µM) do que para a catepsina L (composto1: IC50 = 72,5 µM; composto 2: IC50 = 56,4 µM; composto 3: IC50 = 103 µM) enquanto que os derivados de teluranas orgânicas foram melhores inibidores para a catepsina L (composto 4: IC50 = 0,5 µM; composto 5: IC50 = 0,07 µM) do que para a catepsina S (composto 4: IC50 = 8,4 µM; composto 5: IC50 = 22,9 µM). Destacando os inibidores mais seletivos, observamos que o composto 3 apresenta uma potencia inibitória 60 vezes maior para a catepsina S do que para a catepsina L, enquanto que o composto 5 é 327 vezes melhor inibidor para a catepsina L do que para a catepsina S. Estes inibidores podem ser importantes ferramentas em ensaios onde as duas catepsinas estão presentes..
Assunto Catepsinas
Peptídeo hidrolases
Sensibilidade e especificidade
Idioma Português
Data 2007
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2007. 113 p.
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 113 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/10306

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