Hidrólise enzimática de substratos peptídicos de fluorescência apagada e estruturalmente relacionados com BuXI, inibidor do fator Xa isolado da Bauhinia ungulata

Hidrólise enzimática de substratos peptídicos de fluorescência apagada e estruturalmente relacionados com BuXI, inibidor do fator Xa isolado da Bauhinia ungulata

Título alternativo Enzymatic hydrolysis of peptides quenched-fluorescence substrate structurally related to fator Xa inibidor isolated from Bauhinia ungulata
Autor Andrade, Sonia Aparecida de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Oliva, Maria Luiza Vilela Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo O inibidor especifico de fator Xa obtido de B. ungulata BuXI, e o BvTI obtido de B. variegata inibem quimotripsina, plasmina, calicreina plasmatica e fator XIIa alem de tripsina, mas nao inibem trombina e nem calicreinas tissulares. Apesar da extensa homologa -70 por cento - de sequencia primaria, apenas BuXI inibe o fator Xa (K 1,4 x 10-8 M). Pela sequencia primaria indica, BuXI e BvTI sao inibidores de serinoproteinases do tipo Kunitz, de cadeia polipeptidica unica. Na estrutura do sitio reativo, BuXI e BvTI diferem nos residuos Met59 Thr66 e Met67, que ocorrem no primeiro e sao substituidos por Val59,Ser66 e Leu67 no segundo, e a oxidacao dos residuos de metionina elimina a capacidade de BuXI inibir o fator Xa. Com base na sequencia do sitio reativo de BuXI, subtratos peptidicos de fluorescencia apagada, com arginina no sitio de clivagem, foram sintetizados para fator Xa, trombina, HUPK, POPK e tripsina. O peptideo substrato de fluorescencia apagada Abz-VMIAALPRTMFIQ-EDDnp, usado como peptideo modelo foi hidrolisado pelo fator Xa com alta efiCiência catalitica (Kcat/Km 4,3 x 107 M), aproximadamente quatro ordens de grandeza maiores que a hidrolise do substrato comercial Boc-lle-Glu-Gly-Arg-AMC, empregando-se tripsina bovina como enzima modelo. As modificacoes introduzidas no tamanho do substrato demonstram que a atividade hidrolitica do fator Xa e sensivel as variacoes no tamanho do peptideo. A remocao de residuos de aminoacidos do lado N e C-terminal resulta em decrescimos dos valores da relacao Kcat/Km. Contudo, o tamanho do substrato nao influencia os valores de Km e Kcat na hidrolise pela trombina humana. Ambos os residuos de metionina que ocupam as posicoes correspondentes a Met59 e Met67 influenciam a ligacao com o fator Xa, pois a efiCiência catalitica decresce tres ordens de grandeza quando Met em P7 e substituida por valina, e cinco ordens de grandeza quando Met na posicao P2' e substituida igualmente por valina. A substituicao simultanea de ambos os residuos de metionina no substrato bloqueia a sua hidrolise pelo fator Xa. A substituicao de Thr em P2' por serina tambem diminui a efiCiência catalitica em quatro ordens de grandeza. O substrato peptidico de fluorescencia apagada contendo o sitio reativo de BvTI nao e hidrolisado pelo fator Xa, e tal resultado confirma a especificidade de substrato da enzima, que hidrolisa preferencialmente o peptideo modelo. Quanto a trombina, tanto esse peptideo como seus modificados...(au)
Assunto Substratos
Cinética
Sequência de aminoácidos
Idioma Português
Data 1999
Publicado em São Paulo: [s.n.], 1999. 88 p. ilus., tab.
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 88 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Dissertação de mestrado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/16139

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