Contribuição das proteínas tirosina cinases e cálcio-calmodulina cinase tipo II em modelos animais de epilepsia

Contribuição das proteínas tirosina cinases e cálcio-calmodulina cinase tipo II em modelos animais de epilepsia

Título alternativo Involvement of protein tyrosine kinases and calcium/calmodulin kinase type II in animal model of epilepsy
Autor Queiroz, Claudio Marcos Teixeira de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Mello, Luiz Eugênio Araújo Moraes Autor UNIFESP Google Scholar
Instituição Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Pós-graduação Neurologia/Neurociências - São Paulo
Resumo As epilepsias do lobo temporal são as que apresentam maior refratariedade ao tratamento farmacológico e perfazem 2/3 das intervenções cirúrgicas de epilepsia, sendo portanto de grande custo social, econômico e psicológico. Assim, modelos animais de epilepsia do lobo temporal são de grande relevância não só para o entendimento das bases neurais dessa patologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas capazes de evitar a instalação da doença. Esses são os objetivos da presente dissertação de doutorado. Após um evento traumático (no caso deste trabalho, um estado de mal epiléptico), diversas alterações morfológicas e fisiológicas acontecem, caracterizando a gênese da síndrome epiléptico (epileptogênese). Dentre as alterações podemos destacar a intensa fosforilação de proteínas em resíduos de tirosina e a ativação de diferentes segundos mensageiros. Os dois primeiros capítulos desta tese descrevem a tentativa de bloquear os processos de epileptogênese por meio da inibição da fosforilação de resíduos de tirosma através do tratamento farmacológico com inibidores das tirosina cinases, a herbimicina A e o K-252a. O terceiro capítulo analisa eletrofisiologicamente o circuito neural do giro denteado em animais que apresentavam uma mutação em um sítio inibitório da proteína cálcio/calmodulina cinase do tipo II (CaMK1I). No primeiro capítulo, mostramos que o tratamento agudo com herbimicina A (348M, 5L, icv), é capaz de bloquear a potenciação duradoura (LTP) induzida por um estímulo tetânico bem como de atenuar (~40 por cento) a ativação neuronal (expressão de c-Fos) decorrente de um estado de mal epiléptico induzido pela administração sistêmica de pilocarpina (SE). Apesar dos significativos efeitos agudos, este tratamento mostrou-se incapaz de atenuar a freqüência de crises espontâneas, bem como o padrão de morte neuronal observado após o estado de mal epiléptico induzido pela pilocarpina. Entretanto, o tratamento com herbimicina A alterou o padrão de marcação de metais pesados (Zn+2) no hilo do giro denteado e na região de CA, do hipocampo, porém não apresentou efeito sobre o padrão de brotamento das fibras musgosas observado na camada molecular do giro denteado. No segundo capítulo, mostramos que a herbimicina e o K252a modificam a atividade epileptiforme induzida pela administração intra-hipocampal de ácido caínico, sem alterar o padrão de morte neuronal. Esses resultados sugerem que o tratamento com inibidores de proteínas tirosina cinases é capaz de modificar o padrão de ativação agudo do hipocampo após um estímulo (ie., o estado de mal epiléptico ou a LTP), porém sem qualquer efeito sobre o processo de epileptogênese. No terceiro capítulo, estudamos a excitabilidade e a plasticidade do giro denteado à estimulação da via perfurante (principal aferência da formação hipocampal) em animais que apresentam uma CaMKII geneticamente modificada. Essa proteína uma vez ativada não pode ser inibida. A caracterização eletrofisiológica demonstrou que esses animais apresentam potenciais de campo evocados no giro denteado aparentemente semelhante aos animais controle (wild-type), porém sua responsividade a padrões de estimulação em salvas e sua plasticidade apresentaram clara alteração. Essa modificação foi caracterizada por uma maior variabilidade nas respostas à trens de estimulação (freqüências de 1 e 2 Hz) e maior inibição do pulso pareado em trens de estimulação (para pulsos pareados aplicados a freqüência de 5 Hz). Além disso, conforme já descrito na literatura, mostramos que a susceptibilidade a atividade epileptiforme depende do padrão de estimulação utilizado para os diferentes animais (mutantes vs. wild-type). Assim, utilizando o modelo clássico do abrasamento demonstramos que a mutação não altera a evolução da epileptogênese. Entretanto, ao utilizarmos duas variantes de um padrão de estimulação similar à freqüência teta (5Hz, Intermittent vs. Continuous theta-burst stimulations), demonstramos a importância da mutação na manutenção da excitabilidade do giro denteado. Esses resultados destacam a importância da CaMKII na atividade epileptiforme além de sugerir novas abordagens experimentais (ie., sensibilidade à padrões de estimulação eletrofisiológica) no estudo da epiloptogênese. Em resumo, os resultados apresentados nessa tese contribuem para um melhor entendimento dos fenômenos subjacentes aos processos de plasticidade neuronal e da contribuição destes para o fenômeno de epiloptogênese, além de sugerir abordagens promissoras de intervenção e estratégias farmacológicas de relevância clínica.

Temporal lobe epilepsies are highly refractory to pharmacological treatment. Up to 70% of these patients undergo chirurgical resection of temporal region, procedure with important consequences for the social, economic and psychological spheres. Experimental animal models that mimic temporal lobe epilepsy provide an insightful approach to study the neural basis of epilepsy as well as create opportunities to test promising therapeutic drugs. The present thesis tests the antiepileptogenic activity of two protein tyrosine kinase inhibitors and the relevance of Ca+2/calmodulin kinase type II (CaMKII) mutants. Multiples morphological and physiological alterations take place after a traumatic brain injury (in this thesis, the status epilepticus) leading the animal to an epileptic conditions. During this period, the epileptogenesis process, there is strong tyrsine phosphorylation with the activation of many second messengers. The first two chapters of the thesis describe experiments in which herbimycin A and K-252a, two protein tyrosine kinase inhibitors, were used to attenuate synaptic plasticity and epileptogenesis. The third chapter, the dentate gyrus network was studied after angular bundle stimulation in animals presenting one punctual mutation at the autoinhibitory phosphorylation site of the CaMKII. In the first chapter, we showed that one single herbimycin A injection (348μM, 5μL, icv) was able to attenuate long-term potentiation (LTP) in the commissural CA3 neurons and also, to decrease status epilepticus- (SE-) induced neuronal activation (c-Fos expression) in almost 40%.Although markedly acute effects, the present herbimycin A treatment was not able to diminish spontaneous seizure frequency, cell death or aberrant mossy fiber sprouting observed after the pilocarpine-induced SE. Curiously, herbimycin-treated animals presented decreased neo-Timm staining in the hilus and CA3 region despite the epileptic condition. In the second chapter, we confirmed the ability of protein tyrosine kinase inhibitors to decrease SE-induced neuronal activation. Herbimycin A icv treatment altered the kainic acid-induced epileptiform profile in EEG recordings. Cell death pattern was not altered by any pharmacological treatment. These results suggest that protein tyrosine kinase inhibitiors are able to modify the acute neuronal activation and plasticity (ictogenesis or LTP) but is ineffective in attenuating the epileptogenesis process.In the third chapter, we studied the dentate gyrus excitability and plasticity after angular bundle stimulation in CaMKII mutant animals. Once in its self-sustained mode, this mutation does not allow the reduction of the catalytic activity of the kinase. These animals present normal electrophysiological profiles (similar to wild-type animals) but with reduced amplitude. Shortterm plasticity was clearly altered. Mutant animals presented increased variability in the responses to trains of stimulation at 1 and 2 Hz, and at at 5Hz stronger paired-pulse inhibition. Accordingly to the literature, we also showed that the epileptiform susceptibility depends on the stimulation pattern used in both animals (mutants vs. wild-type). Thus, although the mutation did not altered the behavior and the electrographic kindling evolution, we showed that mutant animals were prone to afterdischarges when stimulate by an intermittent theta-burst stimulation. On the other hand, the same animals needed more bursts to induce afterdischarges when the stimulation was set in the continuos mode.Taken together, the present results contribute to a better understanding of the protein tyrosine kinase and CaMKII function in neuronal plasticity underlying the epileptogenesis process and sum efforts in searching for a clinic antiepileptogenic drug.
Assunto Morte celular
Eletrofisiologia
Animais geneticamente modificados
Quinonas
Idioma Português
Financiador Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX)
Número do financiamento FAPESP: 00/10826-3
Data 2005
Publicado em QUEIROZ, Claudio Marcos Teixeira de. Contribuição das proteínas tirosina cinases e cálcio-calmodulina cinase tipo II em modelos animais de epilepsia. 123 f. 2005. Tese (Doutorado em Ciências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2005.
Editor Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 123 f.
Direito de acesso Acesso aberto Open Access
Tipo Tese de doutorado
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/20515

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